Fluoreszenzmikroskopie

Mikroskopie der Fluoreszenz

Eine besondere Form der Lichtmikroskopie ist die Fluoreszenzmikroskopie. Ein lichtmikroskopisches Verfahren, das auf Fluoreszenz basiert, ist die Fluoreszenzmikroskopie. mw-headline" id="Grundlagen">Grundlagen[Bearbeiten | < Quelltext bearbeiten] Eine Sonderform der Lichtmikroskopie stellt die Fluoreszenzmikroskopie dar...

.. Es basiert auf der physischen Wirkung der Fluorzenz. Bei der Anregung fluoreszierender Substanzen mit Wellenlängenlicht emittieren sie wiederum mit anderen, längeren Breiten (Stokes-Shift). Im Rahmen der Fluoreszenzmikroskopie wird das vergrösserte Abbild des zu untersuchenden Objektes nur durch emittierendes Lichterzeugnis erreicht. Die mikroskopischen Fluoreszenzbilder sind aussagekräftig, wenn die gesamte Mikroskopie nicht einheitlich leuchtet, sondern nur wenige Objekte beleuchtet werden.

Die fluoreszierenden Moleküle in der Zubereitung können als neue Lichtquellen betrachtet werden. Liegen die Intensitäten der von diesen Moleküle emittierten Fluoreszenzen oberhalb der Detektionsgrenze, kann die Fluoreszenzmikroskopie auch zum Erkennen von Gebilden eingesetzt werden, die deutlich kleiner sind als die Lösungsgrenze des Mirkops. Allerdings wird die Lösungsgrenze in der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie nicht überschritten, da es möglich ist, das Lichtsignal in geringem Umfang zu erfassen, aber es ist nicht möglich zu sagen, ob das Lichtsignal durch eine oder mehrere Schichten verursacht wird.

Im Fluoreszenzverfahren sinkt sie vom untersten Anregungszustand in einen der Grund-Zustände. Das fluoreszierende Moleküle haben ein Elektronen, das durch Absorbieren eines Phons von einem niederenergetischen Grundbestandteil (S0) in einen energetisch höher aktivierten Teil ( "S1") wechseln kann. Das emittierte Fluoreszenzlicht ist in seiner spektralen Streuung völlig unabhÃ?ngig von der WellenlÃ?nge des Anregungstrahls.

Der Zeitraum von der Aufnahme über das Erfüllen des geringsten Anregungszustands bis zur Photonenfreisetzung weist eine für eine fluoreszierende Substanz typische Streuung auf. Es wird als fluoreszierende Lebensdauer bezeichnet und ist die Basis für die Fluoreszenzlebensmikroskopie. Fluoreszierende Substanzen werden als Fluoreszenz betrachtet. Fluoreszierende Materialien, die zur Färbung von Präparaten eingesetzt werden, werden als fluoreszierende Farbstoffe oder Fluorchrome bezeichnet. Dabei handelt es sich um Farbstoffe.

Überschneiden sich die Anregungs- und Emissionsspektren von zwei Fluorochromen deutlich, lassen sie sich nicht abgrenzen. So weisen z. B. Fluoreszein, grünes Fluoreszenzprotein, Spektrumgrün und eine Vielzahl anderer handelsüblicher Farben sehr ähnlich gelagerte Spekulationen auf, so dass sie sich nicht durch ihre fluoreszierende Farbe unterscheiden lassen. Sollen zur Färbung unterschiedlicher Struktur mehrere Fluoreszenzfarben parallel verwendet werden, müssen diese Farben ein unterschiedliches Spektrum aufweisen.

Normalerweise reizt die UV-Strahlung blaue Fluoreszenzfarben, das blaue Leuchten reizt die grünen Fluorchrome und das blaue Leuchten reizt die roten Fluorchrome. Bereits acht unterschiedliche Fluorchrome wurden gleichzeitig verwendet. DAPI wurde als blaue Fluoreszenzmischung für DNA und sieben weitere Färbemittel verwendet, die mit den Gensonden zur Fluoreszenzin situ Hybridisierung verbunden sind: 5 ][6] Die meisten fluoreszierenden Mikroskope haben drei bis fünf Farbmesskanäle.

Nicht so bei der Fluoreszenzmikroskopie. Dabei wird das Abbild durch Leuchtstofflicht generiert, das nur in der Probe generiert wird. Weil sich fluoreszierendes Licht unter Normalbedingungen gleichförmig in alle räumlichen Richtungen fortpflanzt, spielt es keine Rolle, ob das Erregungslicht von oben, unten oder von der Himmelsrichtung kommt. In der ersten Jahreshälfte des zwanzigsten Jahrhundert wurden zu den Anfängen der Fluoreszenzmikroskopie Durchlicht-Fluoreszenzmikroskope erbaut.

Zur seitlichen Ausleuchtung wird ein spezielles Fluorzenzmikroskop, das Light Disc Mikroskop (siehe unten), verwendet.

Das Spektrum, in dem der fluoreszierende Farbstoff glüht, darf vom Anregungfilter nicht durchgelassen werden. Durch einen Strahlenteiler wird das Anregerlicht in Richtung des Objektivs reflektiert, woraufhin in der Probe ein Fluoreszenzverhalten erzeugt wird. Das Fluoreszenzverhalten ist langweiliger als das Erregungslicht. Ein Teil des vom Ziel gesammelten Leuchtstofflichts erreicht wieder den Teiler. In modernen Fluorzenzmikroskopen werden die drei erwähnten Partikel oft in einen einzigen Häuserblock integriert.

In umgekehrten fluoreszenzmikroskopischen Systemen ist es unter dem Ziel angeordnet. Im schwarzen Kasten auf der rechten Seite befindet sich die Leuchtmittel für die Fluoreszenzanregung. Filtermodule für grün leuchtende Fluoreszenzfarben. Fluoreszente Moleküle können nicht so oft wie gewünscht angeregt werden, da sie durch das Anregungsthema vernichtet werden können. Das so genannte Photobleaching findet je nach Lichtstabilität der Fluoreszenzzubereitungen früher oder später statt.

Bei einem einzelnen fluoreszierenden Moleküle ist dann ein Verblassen mehr oder weniger sicher. Eine Moleküle im aktivierten Aggregatzustand können nicht nur durch Fluorieren in den Grundbestand (S0) zurückkehren. Es bildet sich viel später nach der Stimulation als fluoreszierende Substanz, es ist die Leuchtstoffröhre. Kurzweiliges Sonnenlicht, insbesondere ultraviolettes Sonnenlicht, kann auch Zellschäden verursachen, ohne dass es zu Fluoreszenzen kommt.

Der Einsatz der Fluoreszenzmikroskopie ist in den Bio-Wissenschaften weit verbreitet. Einige der zu untersuchenden Gegenstände sind von selbst leuchtend. Zum Beispiel haben Pflänzchen Chlorophylle und andere Farbstoffe, die auf natürliche Weise nachleuchten. Allerdings ist die Eigenfluoreszenz oft nicht erwünscht, da es sich um eine Hintergrundsfluoreszenz handelt, die es schwierig macht, künstliche Fluoreszenz zu detektieren. Es wurden zwei unterschiedliche Proteinarten mit roten oder grünen Fluoreszenzmarkern angefärbt.

Zellkerne einer Maus-Fibroblast, die Gebiete der Chromosome 2 (rot) und 9 (grün) wurden durch Fluoreszenzin situ Hybridisierung gefärbt. Hefezelle, in der zwei unterschiedliche Membranteile mit GFP oder RFP (red fluorescent protein) verschmolzen sind. Linke Seite mit Weißlichtreflexion, rechte Fluoreszenzmikroskopie.

Dabei wird der Bildpunkt über die Probe gefahren und die ermittelten Fluoreszenzstärken in einem Steuerrechner zu einem Gesamtbild zusammengefasst. Bei FCS wird die Migrationsgeschwindigkeit von Fluoreszenzpartikeln durch das beobachtete Volumen ermittelt. Ihnen allen ist gemein, dass sie auf der Fluoreszenzmikroskopie basieren. Das Fachmagazin Nature Methods hat die High Resolution Fluoreszenzmikroskopie zur Method of the Year 2008 gewählt.

Werden in der klassischen Fluoreszenzmikroskopie alle Fluoreszenzfarbstoffe simultan stimuliert, werden sie hier der Reihe nach so stimuliert, dass nur ein kleiner Teil von ihnen glänzt. Bei jedem dieser Aufnahmen wird die exakte Lage der fluoreszierenden Fluorchrome ermittelt und diese Lage in das Endbild übernommen. "Der Gegenstand selbst schwingt unter dem Einfluss der auf ihn einfallenden Ultraviolettstrahlung.

Allerdings tritt diese Schwingung bei den meisten Präparaten auf. Das Leuchtstofflicht.... befindet sich ohnehin zum Teil im sichtbarem Spektralbereich;... Es ist offensichtlich, dass dies die Wahrnehmbarkeit des durch die tatsächlich wichtigen, schwierigeren, wenn nicht gar unmöglichen Ultraviolettstrahlen hervorgerufenen Bild.....

So war sich Köhler frühzeitig darüber im Klaren, dass die fluoreszierende Substanz, die die Lichtmikroskopie stört, auch sinnvolle Einsatzmöglichkeiten bieten kann. Zeitgemäße Repräsentation des ersten Fluorzenzmikroskops der Fa. Reichert. Es muss in den kommenden Jahren gelehrt werden, ob und inwieweit das Fluoreszenzmikroskop...[beinhaltet] eine Erweiterungsmöglichkeit des Mikroskopiebereichs bietet.

"Fluororeszenzmikroskop, 1911. , longitudinal, mit Coriphosphin O; .... 10 min Expositionszeit, starke Unterscheidung zwischen Zellkern und Protoplasma". Die Fluoreszenzlampe (5) führte durch das Objekt zum Okular. Bereits in den 1950er Jahren wurde die Fluoreszenzmikroskopie ausschliesslich mit UV-, violett- oder blauen Anregung betrieben. Das Lampengehäuse für die Fluorzenzanregung ist an den Kühllamellen erkennbar.

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